一、核心原理
酵母双杂交（Y2H）技术通过功能重建机制验证蛋白质相互作用，分为两种主流体系：①核体系：依赖Gal4转录因子的模块化特性，其DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）分离时无活性。当BD融合的诱饵蛋白与AD融合的猎物蛋白发生互作，两结构域空间靠近，激活下游报告基因（如LacZ、HIS3）的转录表达。②膜体系：基于拆分泛素（split-ubiquitin）策略，泛素N端突变体（nubG）与C端（cub-TF）随膜蛋白互作而重组，触发TF介导的报告基因表达，专门适用于膜蛋白、分泌蛋白等疏水性分子的研究。
二、系统分类与特性
核体系：以Gal4-BD/AD为核心元件，适用于可溶性核蛋白（如转录因子、DNA结合蛋白）的互作研究，典型应用包括转录因子与共激活因子的结合验证、信号通路蛋白复合体解析等。
膜体系：利用拆分泛素（nubG/cub）作为感应单元，主要针对膜蛋白（如G蛋白偶联受体、离子通道）和分泌蛋白，可用于受体-配体结合筛选、膜蛋白复合物组成分析等场景。
三、标准化实验流程
1.载体构建：将诱饵蛋白编码基因克隆至含BD的载体（如pGBKT7），猎物蛋白基因或cDNA文库克隆至含AD的载体（如pGADT7），确保目的基因与标签蛋白的阅读框一致。
2.酵母转化：采用PEG/LiAc法将重组载体共转化至特定酵母菌株，核体系常用AH109菌株，膜体系多选用NMY51菌株。
3.选择性筛选：转化后的酵母细胞先在SD/-Trp-Leu培养基上筛选成功转化子，再通过SD/-Trp-Leu-His-Ade等营养缺陷培养基，结合3-AT抑制背景，筛选潜在互作克隆。
4.结果验证：对阳性克隆进行β-半乳糖苷酶显色实验，通过显色强度半定量评估互作强度，必要时结合体外Pull-down实验进一步验证。
四、核心应用场景
验证已知蛋白质（或结构域）间的相互作用，为解析蛋白功能复合体提供直接证据；以已知功能蛋白为诱饵，从cDNA文库中筛选未知互作蛋白，构建蛋白质互作网络；定位蛋白质互作的关键结构域，通过截短突变体实验确定互作必需的氨基酸序列。
五、技术优劣势分析
优势：实验操作相对简便，成本低于质谱分析；酵母生长迅速，可实现高通量文库筛选，适合大规模初筛；能在活细胞内模拟生理条件下的蛋白互作。
劣势：假阳性率较高（约15 %-30 %），需通过其他互作验证技术（如Co-IP）交叉确认；核体系仅适用于核内蛋白，对膜蛋白、核外蛋白的检测可信度有限；部分融合蛋白可能存在细胞毒性或折叠异常，影响实验结果。
该技术作为蛋白质互作研究的经典方法，在信号通路解析、疾病相关蛋白网络构建等领域仍发挥着重要作用。
