原核蛋白表达是指利用原核生物（主要是大肠杆菌 （Escherichia coli），也包括枯草芽孢杆菌等）作为宿主，将外源目标基因导入并在其细胞内进行转录和翻译，从而合成重组蛋白的过程。该系统因培养快速、成本低廉、表达量高而广泛应用于科研与工业，但其缺乏真核生物的复杂后翻译修饰，且部分蛋白易形成包涵体，需要通过优化表达条件和纯化策略来获得功能性蛋白。
原核蛋白表达宿主菌株与表达载体的选择
1. 宿主菌株的选择
BL21 系列菌株：最常用的表达宿主，如 BL21(DE3)，因缺乏 Lon 与 OmpT 蛋白酶，可减少重组蛋白降解，配合 T7 表达系统可实现高水平表达。
Rosetta 系列菌株：携带额外稀有 tRNA，可解决真核来源基因在大肠杆菌中的密码子偏好差异问题，提高翻译效率。
Origami、Shuffle 等氧化型菌株：通过改变胞质氧化还原环境，促进二硫键形成，适用于含有复杂结构域的蛋白表达。
C41、C43 等突变株：对有毒或难表达蛋白更为耐受，常用于膜蛋白或代谢负担较大的蛋白。
2. 表达载体的选择
启动子系统：最常见为 T7 启动子（如 pET 系列），表达强度高；若需较温和表达，可选用 tac、trc 或冷诱导启动子。
融合标签设计：His-tag、GST、MBP、SUMO 等标签可增强可溶性并便于亲和纯化，同时可设计特定酶切位点以去除标签。
信号肽元件：如 pelB、ompA 信号肽，可将蛋白导向周质空间，利于二硫键形成和提高可溶性。
质粒拷贝数与选择标记：高拷贝质粒能提高表达量，但可能增加宿主负担；低拷贝质粒适合对宿主敏感或有毒的目标蛋白。
重组蛋白表达纯化策略
1. 融合伴体与提高溶解性
将目的蛋白与融合伴体（fusion partner）如GST、MBP、Trx等融合，有利于促进表达、提高溶解性，并保护蛋白免受降解，同时便于纯化。例如，使用硫氧还蛋白（Thioredoxin, Trx）作为融合伴体，可大幅提高表达溶解性，并通过加Tag（如6×His）简化纯化步骤，之后切除伴体以获得目标蛋白。
此外，对于碱性蛋白，可构建融合保护多肽（如GST、Nus、MBP等）融合策略，通过保护作用避免降解。结合连接肽和酶切位点，既保留表达产量，又能后续切除保护模块。
2. 蛋白表达纯化方法
亲和层析：利用His-tag与Ni²⁺亲和、GST与谷胱甘肽、MBP与淀粉等特异性结合方式，达到高纯度表达蛋白分离；
离子交换、凝胶过滤：进一步提高纯度，去除杂质或进行分子量分级；
组合策略：如实施亲和层析后再进行凝胶过滤或离子交换，以获得高纯度蛋白。
3. 小规模表达测试与优化
在大规模表达前，需进行小规模试表达检测表达溶解性、条件优化（诱导温度、宿主菌株、表达载体等）。例如使用携带冷激蛋白promoter的表达载体，在较低温度（如11℃）下诱导，可显著提高可溶表达几率。
蛋白表达定制服务
1. 目标蛋白及修饰/标签设计：根据实验需求确定是否添加His-tag、GST等融合标签，是否加入酶切位点；
2. 基因合成与密码子优化：针对E. coli 系统进行优化，提升表达效率；
3. 构建表达载体：选择合适promoter（如T7、低温诱导promoter）与融合伴体；
4. 小规模表达筛选：不同诱导温度、菌株、培养方式下检测表达产量与溶解性；
5. 大规模表达与裂解；
6. 蛋白纯化：亲和层析 → 可选凝胶过滤或离子交换等进一步纯化；
7. 酶切去伴体：如需去除融合标签，采用特异性酶处理；
8. 纯化后处理：如脱盐、浓缩、折叠／复性（针对包涵体）；
9. 质量分析：SDS-PAGE、Western blot、活动检测、内毒素检测等。
蛋白修饰策略
虽然原核系统自身不具备复杂翻译后修饰（如糖基化、磷酸化等），但可以通过体外或融合手段实现一定程度的蛋白修饰：
融合标签修饰：如加入His-tag、GST、MBP等，不属于天然修饰，但在纯化、检测和功能研究中具很大帮助；
酶切位点设计：在融合伴体与目标蛋白间设计特异性酶切位点（如Enterokinase, Thrombin, Factor Xa等），用于后续去标签和恢复天然蛋白序列；
体外化学或酶促修饰：表达后可进行磷酸化、泛素化等体外修饰。