在适配体筛选领域，传统方法（如 SELEX）需多轮富集、阴性筛选等复杂步骤，不仅耗时（通常需数周），还易因筛选基质非特异性吸附导致假阳性。而基于大孔 PEG 水凝胶的 “结合 - 扩散筛选法（HAS）”，通过将靶蛋白（凝血酶）固定于抗污染水凝胶基质，实现了适配体的一步式筛选 —— 本文将拆解这一技术的实验设计、核心原理与验证逻辑，揭示其如何解决传统筛选的痛点。
一、HAS 筛选实验设计：从水凝胶预处理到文库释放监测
为验证 HAS 技术对凝血酶适配体的筛选能力，研究以 N40 随机适配体文库筛选对象，设计了 “水凝胶预处理 - 文库加载 - 动态释放监测” 的完整流程，关键步骤如下：
- 水凝胶预处理：将固定凝血酶的大孔 PEG 水凝胶进行部分脱水—— 脱水处理可增大水凝胶内部孔隙的 “吸附容量”，使后续文库加载时能快速渗透至三维网络中；且脱水水凝胶在接触文库溶液后可立即恢复原始形态，确保筛选环境的稳定性。
- 文库加载与动态释放：将 N40 文库加载到凝血酶固定化水凝胶中，随后将水凝胶置于筛选缓冲液中孵育，并在预设时间点收集缓冲液（更换新缓冲液）—— 通过持续更换缓冲液，可逐步洗脱未结合 / 弱结合的适配体，仅保留与凝血酶强结合的候选分子。
- 释放文库分析：采用凝胶电泳与紫外吸收法，定量分析不同时间点收集缓冲液中的适配体浓度，以此评估文库的释放动力学与滞留效率 —— 这是判断筛选是否有效的核心量化指标。
二、筛选特异性验证：如何排除水凝胶基质的背景干扰？
传统筛选中，筛选基质（如磁珠、微孔板）的非特异性吸附常导致假阳性，需额外设计阴性筛选步骤。而 HAS 技术通过 PEG 水凝胶的 “抗污染特性”，从根本上降低了背景噪声，具体验证逻辑如下：
- 空白对照的关键作用：设置 “不含凝血酶的空白 PEG 水凝胶” 作为对照，监测 N40 文库在其中的释放行为 —— 结果显示，空白水凝胶中的文库释放速度极快，60h 时滞留率接近 0%。这一结果证实：PEG 水凝胶本身无明显非特异性吸附，因基质导致的背景噪声已降至最低，无需额外阴性筛选。
- 凝血酶对滞留率的调控效应：对比 “凝血酶固定化水凝胶” 与 “空白水凝胶” 的文库滞留曲线，发现前者在每个时间点的文库滞留浓度均显著更高。其本质是：适配体文库中与凝血酶特异性结合的候选分子，在扩散过程中被固定化凝血酶 “捕获”，扩散速度减慢，从而在水凝胶中滞留；而未结合 / 弱结合分子则随缓冲液快速洗脱 —— 这一 “结合 - 扩散差异” 正是 HAS 技术实现筛选的核心原理。
- ** cutoff 时间点的确定 **：由于 60h 时空白水凝胶的背景噪声已接近 0%，且凝血酶固定化水凝胶的滞留率趋于稳定，研究选择 60h 作为 “富集适配体库收集时间点”—— 此时收集的适配体库中，非特异性结合分子已基本洗脱，富集的主要是与凝血酶特异性结合的候选分子。
三、筛选结果验证：从 SPR 到凝胶迁移，多维度证实适配体活性
为确认 60h 收集的适配体库确实具有凝血酶结合活性，研究通过多种方法进行交叉验证，确保筛选结果的可靠性：
- 表面等离子体共振（SPR）验证：SPR 是检测分子间结合亲和力的金标准。结果显示，60h 收集的适配体库与凝血酶的 SPR 信号显著强于原始 N40 文库—— 这直接证实：经过 HAS 筛选后，文库中凝血酶结合型适配体的比例大幅提升，实现了有效富集。
- 凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）佐证：适配体与凝血酶结合后，形成的 “适配体 - 蛋白复合物” 分子量增大，在凝胶中的迁移速度会减慢（出现滞后带）。60h 适配体库与凝血酶孵育后，滞后带强度显著高于原始文库，进一步从分子互作层面证实了适配体的结合活性。
- 适配体释放实验一致性验证：通过监测适配体从凝血酶固定化水凝胶中的释放速率，发现 60h 收集的适配体库释放速度明显慢于原始文库—— 这与 “强结合分子滞留时间更长” 的逻辑一致，从动态行为角度验证了筛选结果的合理性。
四、筛选条件优化：时间依赖性与靶蛋白浓度阈值的关键影响
为进一步明确 HAS 筛选的关键参数，研究还分析了 “筛选时间” 与 “凝血酶浓度” 对筛选效果的影响，为技术标准化提供参考：
- 筛选时间的依赖性：分别收集 6h、24h、60h 的适配体库，通过 SPR 检测其凝血酶结合活性。结果显示，早期时间点（6h、24h）的适配体库几乎无明显结合信号，而 60h 库的结合信号最强 —— 这表明：HAS 筛选需要足够时间洗脱弱结合分子，只有在后期时间点，才能富集到高亲和力的适配体，体现了 “动态洗脱” 的必要性。
- 凝血酶浓度的阈值效应：将水凝胶中固定的凝血酶浓度降低 10 倍、100 倍后，重新进行筛选。结果显示，低浓度凝血酶组收集的适配体库，与凝血酶的结合活性显著下降—— 这提示：水凝胶中固定的靶蛋白需达到 “阈值浓度”，才能有效 “捕获” 文库中的特异性适配体；若浓度过低，结合位点不足，即使存在高亲和力适配体，也难以被有效滞留，导致筛选失败。
五、HAS 技术的核心优势：对比传统 SELEX，突破三大筛选痛点
相较于传统 SELEX 技术，HAS 技术基于大孔 PEG 水凝胶的设计，展现出三大不可替代的优势：
- 无需阴性筛选：PEG 水凝胶的抗污染特性（非特异性吸附极低），使背景噪声接近 0%，省去了传统 SELEX 中 “用空白基质吸附非特异性分子” 的阴性筛选步骤，大幅简化流程。
- 一步式筛选：从文库加载到富集库收集，仅需 60h 即可完成，无需多轮扩增 - 富集循环（传统 SELEX 需 5-10 轮，耗时 2-4 周），显著提升筛选效率。
- 生理模拟环境：大孔 PEG 水凝胶的三维多孔结构，模拟了体内组织的微环境，适配体与靶蛋白的结合更接近生理状态，筛选出的适配体更具体内应用潜力。
总结：HAS 技术为适配体筛选提供 “高效、简洁” 新范式
本研究通过凝血酶适配体的筛选案例，证实了 HAS 技术的可行性与优越性：其核心是利用 “PEG 水凝胶抗污染 + 靶蛋白固定化 + 动态洗脱” 的组合策略，将传统 SELEX 的多轮步骤压缩为一步，同时通过多维度验证确保筛选结果的可靠性。此外，明确的 “时间依赖性” 与 “靶蛋白浓度阈值”，为 HAS 技术的标准化应用提供了关键参数。
未来，随着水凝胶孔径、靶蛋白固定方法的进一步优化，HAS 技术有望拓展至更多难成药靶点（如 GPCR、PPIs）的适配体筛选，为靶向诊断、药物递送等领域提供高效的分子工具。