一、核心原理
质谱测序通过三步解析蛋白质氨基酸序列：
①离子化：采用电喷雾电离（ESI）或基质辅助激光解吸电离（MALDI），将蛋白质/肽段转化为气态离子；
②质量分析：通过质谱仪（如Orbitrap）测定离子质荷比（m/z），获得一级质谱（MS1）；
③碎片分析：对目标离子进行碎裂（如CID、HCD），生成二级质谱（MS/MS），通过碎片离子质量差推导序列。
二、主流测序策略
1.Bottom-up（自下而上）：用胰蛋白酶将蛋白质消化为7–35个氨基酸的短肽，经分离后MS/MS分析，通过数据库匹配推导完整序列。优势是高通量，适合复杂混合物分析。
2.Top-down（自上而下）：直接分析完整蛋白质，通过碎裂表征蛋白质变体（proteoforms），保留翻译后修饰（PTMs）信息。依赖高分辨率质谱，适用于PTM精准鉴定。
3.Middle-down（中自上而下）：用AspC等蛋白酶产生2.5–10kDa的长肽段，平衡完整性与高通量，兼顾修饰分析与效率。
三、技术进展与优势
1.仪器性能提升：Orbitrap质谱实现ppm级质量精度，可区分谷氨酰胺（Q，128.059Da）与赖氨酸（K，128.095Da）等近似质量氨基酸；电子转移解离（ETD）等技术保留PTMs，与传统碎裂方式互补。
2.算法革新：AI工具（如Prosit）通过深度学习预测碎片谱图，提升匹配效率；DeepNovo等神经网络算法将从头测序（Denovo）准确率提升至传统方法之上。
3.灵敏度突破：可检测attomole级低丰度蛋白，结合多维色谱与离子淌度技术，实现复杂样品中痕量肽段的分离鉴定。
四、核心应用场景
①PTM鉴定：通过质量偏移精准定位磷酸化、糖基化等修饰位点；
②抗体药物分析：Top-down策略解析抗体可变区序列，助力生物药质量控制；
③疾病标志物发现：高灵敏度检测低丰度蛋白，为疾病早期诊断提供依据。
